TÉCNICAS DE EDICIÓN GENÓMICA /Modelos in vitro avanzados de biología vascular: células madre pluripotentes inducidas por el hombre y tecnología de órgano en chip

La vasculatura saludable depende de sus componentes celulares clave que interactúan y funcionan en perfecta sincronía. La lesión del endotelio precede a muchos eventos críticos, uno de ellos es el caso del aneurisma intracraneal acompañado de la hemorragia subaracnoidea. 

Los avances en la generación de tipos de iPSC específicos para el paciente, combinados con los datos del paciente en biobancos y estudios genéticos, así como la tecnología de microfluidos, pueden proporcionar una plataforma para el desarrollo de sistemas in vitro para imitar realmente los fenotipos de enfermedades complejas.

Es posible realizar un modelado in vitro de la enfermedad para comprender el origen de la enfermedad, los procesos, los biomarcadores y las respuestas a los medicamentos para proporcionar datos relevantes al paciente.

Tomado de:

1.- https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0169409X18301467 

Efecto protector de las células madre mesenquimales contra la ruptura de aneurismas intracraneales en ratones

Las células madre mesenquimales son multipotentes y las podemos encontrar en cualquier tipo de tejido, en este caso han sido derivadas de la médula ósea. Las inyecciones intravenosas MSC se han tratado para diversas enfermedades con componentes inflamatorios tanto en animales como en humanos y dado que la inflamación está emergiendo como un componente crucial de la fisiopatología de los aneurismas intracraneales se la usó es esta prueba.

La administración intravenosa de MSCs en un modelo de ratón (con un aneurisma inducido a base de una inyección de elastasa en el LCR) dio lugar a un efecto protector en contra de la ruptura del aneurisma y al parecer está mediada en parte por la estabilización de mastocitos.  

Fuente:

1.-https://academic.oup.com/neurosurgery/article-abstract/81/6/1021/3740075?redirectedFrom=fulltext

Prostaglandina E2-EP2-NF-κB señalización en macrófagos utilizado en ratones transgénicos

El monitoreo del patrón espaciotemporal de la activación de NF-κB durante el desarrollo del aneurisma intracraneal en ratones mostró que NF-κB se activó primero en macrófagos en la adventicia y en las células endoteliales y, posteriormente, en toda la pared arterial. Los ratones con una deleción específica de macrófagos de Ptger2 (que codifica EP2) o la expresión específica de macrófagos de un mutante IκBα que restringe la activación de NF-κB tuvieron menos aneurismas intracraneales con una infiltración reducida de macrófagos y una activación de NF-κB. 

A las ratas a las que se les administró un antagonista EP2 se redujo la infiltración de macrófagos y la formación y progresión de aneurismas intracraneales. Estos resultados indican que los antagonistas de EP2 pueden ser, por lo tanto, una alternativa terapéutica a la cirugía.
Ventajas y desventajas de los transgénicos
Ventajas
- Se producen en cantidades abundantes
- Su obtención es de manera eficaz y rápida
- En el caso de los cultivos transgénicos, estos ya cuentan con sus insecticidas biológicos.
- Animales de consumo modificados para que produzcan o contengan mayor cantidad de proteínas.
- En el caso de alimentos serán más resistentes a factores ambientales
Desventajas
- Pueden tener efectos adversos a largo plazo
- Bioterrorismo
- Desequilibrio ambiental
- Posible producción de células cancerígenas
- El bienestar de los animales peligra

Tomado de:

1.- https://www.neoteo.com/manipulacion-genetica-raton-que-canta-video/

2.- https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/28174280

3.- http://www.conacytprensa.mx/images/Transgenicos_FBolivar.pdf
4.- http://archiv.ipn.uni-kiel.de/eibe/Unit11ES.pdf
5.- https://www.elmundo.es/elmundosalud/2002/08/21/biociencia/1029951498.html

ADN recombinante en la naturaleza

El ADN recombinante contiene genes o partes de genes de diferentes organismos en muchos casos de especies distintas. Un ejemplo de esto es la genética bacteriana.

La recombinación genética es el proceso mediante el cual los elementos genéticos contenidos en el genoma de diferentes individuos se combina. Esto permite que el individuo origine alguna nueva función que pueda dar como resultado una adaptación a los cambios en el medio ambiente, en las procariotas comprende mecanismos independientes de la reproducción celular. Estos mecanismos son llamados transformación, transducción y conjugación.

ADN RECOMBINANTE ARTIFICIAL EN EL ANEURISMA CEREBRAL 

La tecnología tradicional de ADN recombinante basada en endonucleasas de restricción de tipo II hace que el marcado de proteínas sea tedioso e ineficiente, así como la introducción de una secuencia de unión no deseada. En nuestro intento de etiquetar Thrombospondin tipo 1 que contiene el dominio 1 (THSD1) que identificamos como el primer gen de aneurisma intracraneal , desarrollamos una novedosa técnica de etiquetado de precisión mediante el uso combinado de endonucleasas de restricción tipo II e IIS, que genera un clon continuo con alta eficiencia. A diferencia del tipo II, las endonucleasas de restricción de tipo IIS reconocen secuencias no palindrómicas y escinden el ADN fuera de su sitio de reconocimiento.

Tomado de: 

1.- https://www.news-medical.net/life-sciences/What-is-Recombinant-DNA-(Spanish).aspx

2.- https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/29770347

3.- https://bio-protocol.org/e2721

Análisis de secuenciación de ARN. mARN/microARN en un modelo de aneurisma de conejo

Los modelos de aneurisma de conejo se utilizan para probar dispositivos de embolización y también para dilucidar los mecanismos del crecimiento y la curación del aneurisma intracraneal humano. En este estudio se utilizó tecnología de secuenciación de ARN para  reconocer genes de importancia y posibles vías de interés clínico. 

Así el análisis reveló una regulación de algunas vías clave, incluida la inflamación y la presentación de antígenos. ANKRD1 y TACR1 se identificaron como genes de interés en la regulación de metaloproteinasas de matriz.  

Tomado de: 

1.- http://www.ajnr.org/content/36/9/1710#xref-fn-2-1

2.- https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/26228879

Prueba de reacción en cadena de la polimerasa del gen CDKN2BAS en la población china

Tema: Polimorfismos del gen CDKN2BAS y el riesgo de aneurisma intracraneal en la población china.
Objetivo: Demostrar que los polimorfismos del gen CDKN2BAS se correlacionan con el aneurisma intracraneal (IA) en el estudio de personas extranjeras. En el estudio, el autor seleccionó a la población china como objeto de investigación para explorar si los polimorfismos del gen CDKN2BAS se asocian con pacientes chinos con IA.
Muestra: sangre periférica
Ácido nucleico: ADN genómico
Gen: CDKN2BAS 
PCR: PCR-LDR
        Desnaturalización --> 94°C durante 30 segundos
        Extensión --> 72°C durante 1 min/ 35 ciclos
Visualización: EFO

Tomado de:
1.- https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/29228923
2.- https://bmcneurol.biomedcentral.com/articles/10.1186/s12883-017-0986-z
3.- https://cpb-us-w2.wpmucdn.com/blogs.baylor.edu/dist/5/8067/files/2017/04/pcr-components_med-2672qsy.jpg

Prueba de tamizaje y confirmatoria para el aneurisma cerebral

El diagnóstico de aneurisma intracraneal sin ruptura se basa en sofisticadas técnicas de imagenes angiográficas mientras que todavía no se dispone de un biomarcador adecuado para la detección de IA a través de pruebas simples pero sin embargo estudios recientes muestran resultados alentadores. El factor de crecimiento endoteliar (VEGF) aumenta escesivamente en pacientes con IA y posiblemente desempeña un papel protector al estimular la proliferación de fibroblastos y células endoteliales.
La expresión regulada al alza de la proteína quimiotáctica de monocitos 1 (MCP-1) puede promover la formación de IA y ser un potencial biomarcador para la hemorragia subaracnoidea por ruptura del aneurisma.

En cuanto a las pruebas confirmatorias se habla de la angiografía por tomografía computarizada (ATC), angiografía por resonancia magnética (ARM) y la angiografía por catéter. Se han determinado grandes niveles de precisión, sensibilidad y especificidad por parte ATC y ARM aunque en el caso de ATC por la utilización de contraste está contraindicado para pacientes con problemas renales. Con relación a la angiografía por catéter hay que mencionar que es más costosa e invasiva.

Tomado de:

1.- https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4471401/

2.-http://www.neurologyindia.com/article.asp?issn=0028-3886;year=2017;volume=65;issue=4;spage=718;epage=728;aulast=Che

3.- https://es.slideshare.net/marisol_aman/biomarcadores-70116983

Alteraciones en la epigenómica del aneurisma cerebral

Tomando en cuenta la definición de epigenética, es decir, la expresión genética que hace que únicamente se expresen los genes que se necesitan, en el momento que se necesite sin necesidad de que se altere la secuencia de ADN. 

Cofactores como hierro hem, BH4 (tetrahidrobioterina) y L-arginina han sido particularmente estudiados, y la baja biodisponibilidad de estos induce al fenómeno de la eNOS disfuncional. El hierro heme es esencial para la dimerización de las tres isoformas de NOS, bajas concentraciones o ausencia de L-arginina catalizan la reducción del oxígeno en superóxido (O2 .-), y niveles disminuidos de BH4 llevan a la producción simultánea de NO y O2, productos que reaccionan entre si formando peroxinitrito (ONOO-) que es un agente oxidante y puede dañar gran variedad de moléculas en la célula. 

Entre los factores de riesgo adquiridos se encuentran: la edad avanzada, consumo excesivo de alcohol, hipertensión, arterosclerosis y el consumo de drogas. 

Tomado de: 

1.- https://revistageneticamedica.com/epigenetica/

2.- http://www.scielo.br/pdf/abc/v96n1/es_v96n1a12

3.- https://es.wikipedia.org/wiki/Peroxinitrito

4.- https://drcosmevillaman.wordpress.com/2016/11/06/aneurisma-cerebral/

5.- https://www.mayoclinic.org/es-es/diseases-conditions/brain-aneurysm/symptoms-causes/syc-20361483

Alteraciones en la traducción del aneurisma cerebral

La actividad de la eNOS es bien conocida en el ambiente vascular. Su regulación está dada por seis mecanismos después de su traducción: inclusión de lípidos, mecanismo calcio/calmodulina dependiente, interacciones directas proteína-proteína, diferentes fosforilaciones sitio dirigidas, glucosilación y disponibilidad de substratos y cofactores. Así, la eNOS puede interactuar con varias proteínas en sus estados “menos activos” o “más activos”. La secuencia polipeptídica generada contiene 1.203 aminoácidos.

La eNOS está ubicada en el cromosoma 7q35-36, y variaciones en su secuencia han sido descritas en la región promotora, exones e intrones. El gen (21- 22 kbp) comprende 26 exones y 25 intrones con 133 kDa.  Ya está descrito anteriormente la existencia de polimorfismos de un único nucleótido (SNP) en la región promotora, en localizaciones de no ligazón de factores de transcripción. En los intrones 2, 11, 12, 18, 22 y 23, fueron encontrados SNP y polimorfismos de secuencias repetidas en los intrones 2, 4, 8 y 13. De los polimorfismos encontrados en los exones 6 y 7, la sustitución de la base nitrogenada guanina por timina (G→T), en la posición 894 ubicada en el exón 7, resulta en la sustitución del aminoácido glutamato (GAG) por aspartato (GAT) en la posición 298 de la secuencia polipeptídica. Se sugiere que los polimorfismos ubicados en la región promotora del gen desempeñan influencia en la transcripción del RNAm, mientras que los polimorfismos ubicados en regiones codificadoras pueden resultar en alteración de actividad enzimática... 

Tomado de:

1.- http://www.scielo.br/pdf/abc/v96n1/es_v96n1a12

2.- https://www.mdsaude.com/es/2015/11/aneurisma-cerebral.html

3.- https://www.nature.com/articles/nrneurol.2016.150

Alteraciones de la transcripción en el aneurisma cerebral

Al hablar de transcripción nos referimos al proceso por el cual la secuencia de ADN  de un gen se copia para hacer una molécula de ARN. Las investigaciones que demostraron asociación de la variante G894T del gen de la eNOS con fenotipos cardiovasculares señalan una posible reducción de la biodisponibilidad del NO, sugiriendo que la eNOS transcrita del alelo mutante presenta actividad enzimática alterada. Además de los polimorfismos hallados en el gen eNOS3 y en los intrones ubicados en la región promotora del mismo se establece que desempeñan influencia en la transcripción de ARNm. 

Tomado de:

1.- https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0009741115001292

2.- http://www.redalyc.org/html/662/66242708003/

Alteraciones genéticas en el aneurisma cerebral

Aunque su etiología sea desconocida se piensa que las alteraciones en los genes que sintetizan la óxido nítrico sintetasa (NOS), específicamente el gen NOS3, que participa tanto en funciones hemodinámicas como estructurales y su ausencia o disminución podría provocar debilitamiento de la pared vascular o una rotura, incidiendo en la susceptibilidad para la formación de aneurismas coronarios y cerebrales. NOS tiene tres isoformas conocidas, iNOS inducible, nNOS neuronal y eNOS endotelial, esta última que actúa directamente en el tejido endotelial como su nombre lo menciona; su importancia también radica en el hecho de que el producto de NOS, es decir NO,  es el vasodilatador endógeno más potente que se conoce. Reportaron que el genotipo TT del polimorfismo G894T del gen eNOS3 es significativamente frecuente en pacientes con aneurisma intracraneal roto.

Tomado de:

1.- https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0009741115001292

2.- https://es.wikipedia.org/wiki/%C3%93xido_n%C3%ADtrico_sintasa

Aneurisma Cerebral

Se define como la dilatación que se da lugar en un vaso sanguíneo del lecho cerebral. Esto se deriva del debilitamiento o la degeneración de la pared vascular lo que ocasiona la elongación progresiva del vaso sanguíneo hasta su posible ruptura. Frecuentemente el colapso de este aneurisma cerebral se da en la zona entre el tejido cerebral y las delgadas capas que lo recubren (duramadre, aracnoides y piamadre) pasando a denominarse hemorragia subaracnoidea (HSA), tiene un alto índice de morbilidad y mortalidad a pesar de los grandes avances en los últimos años. La mayoría de estos aneurismas son pequeños y asintomáticos por lo que su diagnóstico es accidental al realizarse exámenes de imagen cómo una tomografía computarizada o una resonancia magnética por alguna otra causa.

Tomado de:
1. https://www.cirugia-neurologica.org/aneurisma-cerebral.ws
2. https://www.mayoclinic.org/es-es/diseases-conditions/brain-aneurysm/symptoms-causes/syc-20361483

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